研究背景腹膜透析是終末期腎臟病的主要替代治療方式之一,全球大約有11%的終末期腎臟病患者需要接受腹膜透析治療。但是長期腹膜透析治療會導致腹膜纖維化。炎癥是腹膜纖維化最關鍵的病理生理過程,巨噬細胞參與透析后腹膜炎癥反應。目前防治腹膜纖維化主要有兩大策略:一是腹腔內給藥抑制纖維化進展,二是換用理化性質溫和的非葡萄糖腹膜透析液。從臨床轉化角度看,第一種策略會增加潛在腹腔感染風險且全身作用不明確;第二種策略即便換為非葡萄糖透析液長期應用仍可能出現腹膜纖維化。因此為開發安全高效的新型腹膜透析液,尋找安全、無毒的抗纖維化物質是預防腹膜纖維化的難點。氫氣是無色無味的小分子氣體,可中和活性氧,發揮抗氧化抗炎癥作用。據報道分子氫可以預防腎臟、肝臟、心臟和肺組織纖維化。然而分子氫對腹膜纖維化的保護機制仍未不明確,需要進一步研究。PTEN是作用于多肽和磷酸肌醇底物的磷酸酶,主要功能是催化PIP3去磷酸化,抑制PI3K/AKT/mTOR途徑來控制多種細胞過程。本研究旨在探討分子氫是否具有治療腹膜纖維化的潛力及是否能夠通過PTEN發揮其抗纖維化作用。
研究目的一、明確分子氫對于改善腹膜透析相關腹膜纖維化的作用。二、探索分子氫發揮抗纖維作用的可能分子機制,為分子氫的生物學作用提供理論依據。研究方法一、動物模型與分組27只體重在22-26g之間的C57BL/6雄性小鼠被隨機平均分成3組,分別是生理鹽水組(Saline)、高糖腹膜透析液組(HG)和富氫高糖腹膜透析液治療組(HGH;氫濃度為1.0-1.5mg/L)。生理鹽水組小鼠腹腔注射2ml生理鹽水,一天一次,連續注射28天。高糖腹膜透析液組小鼠腹腔注射4.25%高糖腹膜透析液2ml,一天一次,連續注射28天。富氫高糖腹膜透析液治療組小鼠腹腔注射富氫高糖腹膜透析液2ml,一天一次,連續注射28天。二、組織病理染色小鼠腹膜組織取材固定后,進行石蠟包埋,切片。按照HE、Masson、免疫組織化學和組織免疫熒光的實驗步驟進行染色。使用白光或熒光顯微鏡進行拍照。三、腹膜功能檢測造模28天后,各組小鼠腹腔注射2ml生理鹽水,兩小時后麻醉小鼠,并打開腹腔用干燥棉球吸取未被腹膜吸收的生理鹽水來間接評估小鼠腹膜功能(計算公式:吸收率=(總注射生理鹽水質量-干濕棉球質量差)/總注射生理鹽水質量*100%)。四、細胞培養與干預細胞采用M199培養基,10%FBS,1%雙抗,37℃,5%CO2的條件進行培養。使用濃度梯度的葡萄糖(0mM、25 mM、50 mM、100 mM、150 mM、200 mM)處理MET5A細胞24h;使用含氫細胞培養箱培養MET5A細胞(培養基氫濃度0.6-0.8mg/L);細胞干預分甘露醇對照組(Mannitol)、高糖刺激組(HG)、高糖刺激加氫組(HGH)和甘露醇加氫組(MH)。五、細胞內ROS檢測按照1:1000用無血清培養液稀釋DCFH-DA,使終濃度為10微摩爾/升。加入到處理好的細胞當中,37℃孵育20min。使用流式細胞儀和熒光成像技術檢測細胞DCF熒光強度。六、細胞線粒體膜電位檢測按照試劑盒要求對待檢測細胞進行JC-1染色,細胞培養箱中37℃孵育20min。利用流式細胞儀檢測細胞線粒體膜電位。七、細胞免疫熒光使用腔室載玻片培養細胞,細胞刺激干預之后,用多聚甲醛固定2h。用0.5%TritonX-100室溫打孔20min,用含5%山羊血清的PBS封閉1h。一抗4℃孵育過夜。加入熒光標記的二抗(1:500),37℃避光孵育1h。用DAPI避光孵育5min染細胞核。滴加防熒光淬滅劑之后進行封片,通過熒光顯微鏡觀察結果并拍照。八、細胞轉染(miRNA mimic)以6孔板為例進行細胞轉染操作。A管125μl Opti-MEM無血清培養基中加入5ul20μM濃度的RNA mimic。B管125μl Opti-MEM無血清培養基中加入3.75μl lipo3000試劑,混勻室溫放置12 min。然后將試劑加入到6孔板當中,放入細胞培養箱繼續培養。九、過表達細胞株構建利用外源性接入目的基因的方式進行過表達質粒的構建。對質粒進行轉化擴增與抽提之后,用慢病毒包被質粒形成過表達病毒。用過表達PTEN的慢病毒感染細胞后,使用嘌呤毒素進行細胞株抗藥性篩選,RNA或蛋白進行驗證后得到穩轉細胞株。十、組織與細胞蛋白檢測使用總蛋白提取試劑提取組織和細胞蛋白(按照1:100將PMSF、蛋白酶抑制劑和磷酸化酶抑制加入到蛋白裂解液中)。通過BCA法測的蛋白濃度,加入蛋白上樣緩沖液煮沸負20℃冰箱保存。通過western blot蛋白免疫印跡法進行組織和細胞蛋白表達水平檢測。十一、組織與細胞RNA檢測使用Trizol法提取組織或細胞總RNA,通過酶標儀檢測RNA濃度。使用mRNA反轉錄試劑或者miRNA莖環法反轉錄試劑得到樣本的cDNA,利用SYBR Green染料法對樣本進行實時熒光定量PCR的檢測。十二、生物信息學預測使用NCBI GEO DataSets中的數據驗證PTEN表達水平,使用miRTargetLink Human網站預測PTEN相關miRNA。十三、統計學方法實驗數據采用(均數±標準誤)表示,應用GraphaPad 7.0軟件進行統計圖表繪制與統計數據分析。實驗涉及到兩組樣本比較的,采用兩獨立樣本t檢驗,實驗涉及多組比較的,采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。p<0.05表示組間有統計學差異。
結果一、分子氫改善高糖對間皮細胞活力及氧化應激的影響(一)細胞活力檢測實驗CCK8結果提示分子氫可以改善高糖導致的MET-5A細胞活力的下降。(二)MET-5A細胞內ROS水平隨葡萄糖濃度的升高而升高并引起線粒體膜電位的下降,分子氫能夠抑制葡萄糖誘導產生的ROS,并且通過上調線粒體膜電位改善線粒體功能。二、分子氫抑制高糖誘導腹膜間皮細胞EMT與纖維化(一)通過定量PCR和細胞免疫熒光實驗發現分子氫在mRNA和蛋白水平能夠抑制高糖誘導MET-5A間皮細胞EMT,表現為抑制上皮指標E-cadherin的丟失和間質指標Vimentin的增加。(二)通過組織蛋白印跡和免疫熒光實驗提示高糖腹膜透析液能夠引起小鼠腹膜間皮細胞發生EMT改變(E-cadherin下降,Vimentin升高),而分子氫治療能夠上調E-cadherin、下調Vimentin的表達抑制小鼠腹膜EMT改變。(三)細胞免疫熒光和蛋白免疫印跡實驗結果顯示分子氫能夠在體外抑制MET-5A細胞在高糖刺激后纖維化指標FN表達增加的現象。(四)小鼠腹膜組織病理結果提示高糖腹膜透析液處理后的小鼠腹膜厚度明顯增加,且纖維化相關指標FN、α-SMA和MMP1顯著高表達,分子氫治療組小鼠腹膜厚度及FN、α-SMA和MMP1的表達顯著減少。同時小鼠腹膜功能實驗顯示分子氫能夠改善高糖誘導的小鼠腹膜功能的下降。三、PTEN介導腹膜纖維化且與高糖誘導ROS產生有關(一)通過NCBI GEO數據庫檢索發現GSE62928編號數據樣本為腹膜透析患者腹膜組織,數據提示PTEN在發生包裹性硬化的腹膜組織中低表達。同時利用蛋白免疫印跡的方法檢測腹膜超濾衰竭患者和對照患者腹膜組織中PTEN的表達水平,發現超濾衰竭患者腹膜組織中的PTEN表達低于對照患者。(二)通過蛋白免疫印跡實驗發現PTEN表達隨葡萄糖濃度的升高而下降具有劑量依賴性,同時ROS誘導劑過氧化氫誘導PTEN下降也有劑量效應關系。為明確ROS在高糖誘導PTEN下調中的作用,使用NAC清除高糖刺激后產生的ROS,發現清除ROS后PTEN表達上調。四、高糖通過PTEN激活PI3K/AKT/mTOR通路誘導纖維化發生且分子氫可以抑制這一過程(一)高糖刺激MET-5A細胞后,PI3K/AKT/mTOR通路激活,Vimentin表達升高。PTEN是該通路上游的調控因子,通過過表達PTEN能夠有效抑制高糖誘導mTOR活化,進而抑制了Vimentin表達。(二)蛋白免疫印跡實驗顯示分子氫干預后,被高糖激活的PI3K/AKT/mTOR通路能夠被分子氫所抑制,進而抑制了下游活化的Smad蛋白。五、miR-718介導分子氫上調PTEN抑制高糖誘導的腹膜纖維化(一)通過miRTargetLink Human網站尋找到123個與PTEN相關聯的miRNA,其中有51個強關聯。選擇強相關miRNA進行下一步驗證發現miR-718在細胞、小鼠腹膜纖維化模型和人纖維化腹膜組織中高表達,同時細胞和動物模型中發現分子氫能夠回調高糖引起的miR-718的上調。(二)高糖環境培養的MET-5A細胞轉染miR-718 mimic后,PTEN表達水平進一步下調,PI3K/AKT/mTOR通路進一步被激活,纖粘蛋白FN表達增加。同時分子氫在細胞轉染miR-718 mimic后同樣抑制了PI3K/AKT/mTOR激活與FN的表達。
結論一、分子氫能夠有效緩解腹膜透析相關腹膜纖維化,改善腹膜功能。二、分子氫的抗纖維化作用可能是通過清除ROS抑制miR-718上調PTEN抑制PI3K/AKT/mTOR途徑實現的。
